紫花苜蓿是世界上最早培育和驯化的优良豆科牧草作物，被誉为“牧草之王”。苜蓿硬实非常普遍，一般表现为种皮不透水而使种子发芽失败，被认为是典型的物理休眠（PY）。由于紫花苜蓿硬实种子和非硬实种子在外观形态上没有明显的差异，传统检测硬实种子最方便有效的方法是进行种子吸水萌发，但这种方法会破坏非硬实种子的种皮结构，且耗时较长，从而导致苜蓿硬实种子和非硬实种子的分子研究受到阻碍。作者以紫花苜蓿种子为材料，利用VideometerLab 4多光谱成像技术结合多元分析模型，实现了硬实种子和非硬实种子快速无损鉴别，并在此基础上开展了生理、转录组、代谢组和DNA甲基化等分析，解析出苜蓿硬实种子的多组学差异，提出了苜蓿硬实种子“物理休眠+生理休眠”的综合休眠模式（PY+PD），为深入研究紫花苜蓿硬实种子提供了技术和理论依据。

研究者利用多光谱技术成功实现了紫花苜蓿硬实种子与非硬实种子快速无损鉴别，准确率高达96.8%~99.0%，通过nCDA模型的二次验证，准确率可达100%（表1、图1）。非靶向代谢组学分析发现，差异代谢物主要与类黄酮、脂类和激素的生物合成有关，特别是硬实种子的脱落酸（ABA）含量显著升高（图2）。转录组分析发现差异表达基因富集到“脱落酸反应”途径，进一步支持了植物激素（特别是ABA）对硬实种子的影响（图3）。通过对硬实种子和非硬实种子DNA甲基化分析发现，存在54,899个CpG背景下的差异甲基化区域（DMR），其中344个差异表达基因可能受DNA甲基化的调控（图4）。验证试验表明，紫花苜蓿种子硬实率为8%，但有24.5%的硬实种子擦破种皮后仍不能萌发，将其定义为“非物理休眠的硬实种子”。与硬实种子相比，“非物理休眠的硬实种子”中ABA/IAA和ABA/JA含量显著升高（图5）。综上，研究者提出紫花苜蓿硬实种子可能不是单一的物理休眠，而是“物理休眠+生理休眠”的综合模式。该研究结果为紫花苜蓿种子休眠模式的深入研究奠定了基础。表1 基于SVM、LDA、RF和ELM模型的硬实种子和非硬实种子预测

SVM,support vector machine; LDA, linear discriminant analysis; RF, random forest; ELM, extreme learning machine.

图1多光谱鉴定硬实种子和非硬实种子

图2硬实种子和非硬实种子的差异代谢物和KEGG富集分析

图3硬实种子和非硬实种子的转录组分析

图4 硬实种子和非硬实种子的高甲基化和低甲基化比较

图5 “非物理休眠硬实种子”激素变化

Videometer种子表型表型成像系统可测量种子如尺寸、颜色、形状等，间接测定种子参数如种子纯度、发芽百分比、发芽率、种子健康度、种子成熟度、中寿命等。种子活力综合种子活力是种子发芽和出苗率、幼苗生长的潜势、植株抗逆能力和生产潜力的总和（发芽和出苗期间的活性水平与行为），是种子品质的重要指标，具体包括吸涨后旺盛的代谢强度、出苗能力、抗逆性、发芽速度及同步性、幼苗发育与产量潜力。种子活力是植物的重要表型特征，传统检测方法包括低温测试、高温加速衰老测试、幼苗生长测定等。

该系统也可以对细菌、虫卵、真菌等进行高通量成像测量，进行病理学、毒理学或其它研究。对于拟南芥等冠层平展的植物，可以进行自动的叶片计数等。

Multiple omics datasets reveal significant physical and physiological dormancy in alfalfa hard seeds identified by multispectral imaging analysis

Abstract

Physical dormancy (PY) commonly present in the seeds of higher plants is believed to be responsible for the germination failure by impermeable seed coat in hard seeds of legume species, instead of physiological dormancy (PD). In this study, a non-destructive approach involving multispectral imaging was used to successfully identify hard seeds from non-hard seeds in Medicago sativa, with accuracy as high as 96.8%–99.0%. We further adopted multiple-omics strategies to investigate the differences of physiology, metabolomics, methylomics, and transcriptomics in alfalfa hard seeds, with non-hard seeds as control. The hard seeds showed dramatically increased antioxidants and 125 metabolites of significant differences in non-targeted metabolomics analysis, which are enriched in the biosynthesis pathways of flavonoids, lipids and hormones, especially with significantly higher ABA, a hormone known to induce dormancy. In our transcriptomics results, the enrichment pathway of “response to abscisic acid” of differential expressed genes (DEG) supported the key role of ABA in metabolomics results. The methylome analysis identified 54,889, 46,216 and 54,452 differential methylation regions for contexts of CpG, CHG and CHH, and 344 DEGs might be regulated by hypermethylation and hypomethylation of promoter and exon regions, including four ABA- and JA-responsive genes. Among 8% hard seeds in seed lots, 24.5% still did not germinate after scarifying seed coat, and were named as non-PY hard seeds. Compared to hard seeds, significantly higher contents of ABA/IAA and ABA/JA were identified in non-PY hard seeds, which indicated the potential presence of PD. In summary, the significantly changed metabolites, gene expressions, and methylations all suggested involvement of ABA responses in hard seeds, and germination failure of alfalfa hard seeds was caused by combinational dormancy (PY+PD), rather than PY alone.

Keywords

Hard seed Multispectral imaging Transcriptomics Metabolomics ABA

相关阅读

Videometer种子表型组学:种子活力研究-荧光成像

植物病害表型组学：多光谱病害指纹图谱

Videometer种子表型组学：多光谱成像作为菠菜种子健康检测的潜在工具

Videometer种子表型组学：多光谱图像分析在种子种质库管理中的应用

Videometer种子表型组学：利用可见光、近红外多光谱和化学计量学对不同番茄种子品种的分类

Videometer种子表型组学：使用多光谱成像和化学计量学方法在线鉴别水稻种子

Videometer种子表型组学：使用多光谱成像预测蓖麻种子的活力

Videometer种子表型组学：甜菜种子加工损伤的多光谱图像分类

种子表型组学：基于多光谱成像的葵花籽品质特征识别

种子表型组学：利用多光谱成像和化学计量学方法对大豆种子进行无损鉴别

种子表型组学：Videometer多光谱成像种子质量评估的新工具

种子表型组学：聚合物包衣对水稻种子萌发的影响

种子表型组学：基于可见-近红外多光谱图像数据的偏最小二乘判别分析检测菠菜种子的发芽能力和胚芽长度

种子表型组学：使用灰度共生矩阵和机器学习技术识别单倍体玉米种子

种子表型组学：不同成熟度甜菜种子发芽抑制因子去除的优化

种子表型组学：通过射线照相和多光谱图像分析测定小麦种子中的侵染

种子表型组学：用于表征麻疯树种子质量的多光谱和X射线图像

种子表型组学：盐胁迫下九个高羊茅品种的种子萌发和幼苗生长参数

种子表型组学：多光谱成像结合机器学习判别辣椒种子品种

种子表型组学：叶绿素荧光作为花生种子品质评价的新标志物

种子表型组学：基于多光谱和共振成像技术的麻疯树种子健康分析新方法

种子表型组学：多光谱成像结合多变量分析的单株紫花苜蓿种子品种鉴别

基于机器学习和多光谱成像分类的茄子种子分类方法研究

种子表型组学：通过多光谱成像分析对自然老化的紫花苜蓿种子进行无损鉴定

种子表型组学：自动荧光光谱成像作为一种快速、无损和可靠地评估大豆种子质量的创新方法

种子表型组学：一种利用新兴光学技术和人工智能的方法作为新标记评估花生种子质量

种子表型组学：用多光谱成像检测黑燕麦种子中的德雷克斯孢菌

种子表型组学：多光谱成像结合机器学习方法快速无损检测玉米中玉米赤霉烯酮

种子表型组学：多光谱成像如何无损检测苜蓿种子活力表型？

种子表型组学：基于多光谱成像技术快速无损检测紫花苜蓿人工老化种子

种子表型组学-多光谱种子表型成像系统：基于多光谱成像和叠加集成学习的三种苜蓿单种子鉴定

种子表型组学：通过多光谱成像预测水稻酚类和矿物质含量的数学模型

种子表型组学：多光谱系统综述-新技术：高活力大豆种子的活力评估和生产策略

种子表型组学：X射线、多光谱和叶绿素荧光图像：评估水稻种子生理潜力的创新方法

种子表型组学：燕麦（Avena sativa L.）种子品种的多光谱成像分析

种子表型组学：通过作物管理和成像减少小麦制品中丙烯酰胺的膳食暴露

种子表型组学：多光谱成像系统-用于种子参数的RIL群体的形态生化特征以及调节扁豆种子大小性状的候选基因的鉴定

种子表型组学：通过多光谱图像识别花生种子中的真菌：提升健康质量的技术进展